GENETICA PECUARIA C.A. - *Transplante Embrionario en Bovinos

Transferencia de embriones en bovinos: métodos y técnicas

[ Introducción ]

Hasta hace algunos años la colección y transferencia de embriones en bovinos se realizaba en forma quirúrgica por lo que se hacía muy difícil su aplicación en terreno (Rowson y col, 1969). El desarrollo de nuevos instrumentos, métodos de colección y colocación de los embriones en hembras receptoras, abrió la posibilidad de usarla como una técnica más en los programas reproductivos en animales de alto pedigree en los criaderos (Rowe y col, 1976; Eldsen y col, 1976, Rowe y col, 1980a).

Hoy, la técnica de transferencia de embriones, se practica en forma rutinaria en muchos países en el mundo. Es así como en U.S.A., solamente, en el año 1983 se transfirieron 71.637 embriones en forma comercial (Embryo Transfer Newsletter, 1984).

La aplicación de la transferencia de embriones a nivel de criaderos en Chile comenzó en 1981 (Del Campo, 1983), aproximadamente 3 años después de haberse comunicado el primer nacimiento de una cría obtenida por esta técnica (Correa y col, 1980).

En Chile, desde junio 1981 hasta diciembre 1983 se realizaron 310 transferencias con resultados de preñez similares a los obtenidos en otros países más avanzados. En su gran mayoría las donantes de embriones han sido de razas de leche provenientes de criaderos ubicados en diferentes lugares del país.

Las razones principales de su aplicación en los criaderos nacionales han sido: 1) mejorar la calidad genética del criadero usando donantes importados de alta producción o hijas de animales importados nacidas en el país, 2) Obtener crías de hembras seniles de alta calidad que no son capaces de llevar a término una preñez, 3) El deseo del criador de tratar algo novedoso.

Este trabajo tiene como objetivo presentar una revisión general sobre la forma de realizar un programa de transferencia de embriones en bovinos, en condiciones de terreno dando énfasis principalmente a una técnica no quirúrgica de colección y a las técnicas quirúrgica y no quirúrgica de colocación de los embriones en las receptoras.

[ Generalidades ]

Antes de comenzar un programa de transferencia de embriones es recomendable analizar una serie de detalles relacionados con el criadero en general y especialmente con las donantes y receptoras que se usarán. Por ejemplo el usar donantes subalimentadas o con problemas reproductivos, éstas no responderán en forma óptima al ser sometidas a grandes dosis de gonadotrofinas (superovulación). Al igual receptoras de dudosa calidad reproductiva o sanitaria (muchas veces sucede que el criador compra hembras a terceros para usarlas como receptoras) disminuirán las posibilidades de obtener un alto porcentaje de preñez. También, un semen de mala calidad dará como resultado una alta proporción de oocitos no fertilizados. Además de lo anteriormente mencionado, debe tenerse presente el equipo de colección y transferencia, las hormonas, esquema de tratamientos, etc.

[ Definiciones ]

CICLO ESTRAL

La vaca tiene un ciclo estral de 21 días aproximadamente durante el cual se suceden una serie de cambios fisiológicos, endocrinos, morfológicos y psíquicos en el animal (Hansel, 1959). Debido a que estos cambios ocurren en ciertos días específicos del ciclo, éste se ha dividido en períodos, designados como: estro, metaestro y proestro. Este ciclo puede ser interrumpido o prolongado por una preñez o una situación anormal.

Las hormonas que controlan el ciclo estral son producidas fundamentalmente por la glándula hipófisis y ovarios (Fig. 1).

Figura 1. Hormonas y estructuras ováricas durante el ciclo estral de la vaca.

ESTRO, CELO, CALOR (día 0)

Tiene una duración aproximada de 24 horas y se caracteriza por presentar manifestaciones externas en la hembra que pueden ser fácilmente distinguidas (inquietud, mugidos, edematización y enrojecimiento vulvar, montan o se dejan montar por otros animales del rebaño, etc.). En los ovarios se desarrolla un folículo por la acción de la hormona folículo estimulante (FSH), este folículo alcanza un tamaño aproximado de 20–25 mm. en diámetro. La hormona predominante en este período es el estrógeno producido por los folículos. Treinta horas después de haber comenzado las manifestaciones de estro se producirá la ovulación por la acción de la hormona luteinizante (LH) producida por la hipófisis.

METAESTRO (día 1–4)

Los niveles de estrógeno y progesterona son bajos y el útero se prepara para recibir el embrión.

DIESTRO (día 5–17)

Se forma el cuerpo lúteo (CL) a partir del folículo que dio origen al oocito. La hormona predominante es la progesterona producida por el CL. Esta hormona prepara al útero para la futura anidación del embrión.

En el caso de no haber fertilización, el día 16 aproximadamente se producirá la regresión del CL, lo que traerá una baja en los niveles de progesterona, una alza en los niveles de FSH, la formación de un nuevo folículo, una alza de estrógeno, aumento de los niveles de LH y una nueva ovulación.

PROESTRO (día 18–20)

Es el período en que la hembra se prepara para ser cubierta. Los niveles de estrógeno aumentan rápidamente.

FOLICULOS Y OOCITOS

Los ovarios de una hembra bovina al nacer tienen aproximadamente 200 mil oocitos primarios que teóricamente al ser fertilizados pueden dar origen a un ser (Callesen y Greve, 1983).

Sin embargo, sólo un oocito es eliminado desde un folículo cada 21 días.

Como se observa, los ovarios contienen 1.000 veces más oocitos que los que maduran y ovulan durante la vida productiva de un animal.

SUPEROVULACION

Haciendo tratamientos en base a grandes dosis de gonadotrofinas durante la fase luteal del ciclo se logra producir una maduración mayor de folículos que potencialmente darán origen a oocitos, esto se conoce como superovulación.

En transferencia de embriones se utiliza la superovulación para obtener mayor cantidad de oocitos, a partir de hembras genéticamente superiores y así, aumentar su capacidad reproductiva.

Las gonadotrofinas más comúnmente usadas para inducir superovulación en bovinos son la hormona folículo estimulante porcina (FSH–P) y la gonadotrofina sérica de yeguas preñadas (PMS–G).

Un tratamiento de superovulación con estas hormonas se comienza generalmente durante los días 8–14 del ciclo estral en animales que presentan un CL bien desarrollado (Fig. 2).

Figura 2. Esquema representando los eventos que suceden durante el tratamiento de superovulación, inseminación y colección en la vaca. El tratamiento con FSH-P comienza el día 10 del ciclo estral, el celo está indicado como día 0, la inseminación es múltiple y la colección se realiza 6-8 días después del celo.

Esquema representando los eventos que suceden durante el tratamiento de superovulación, inseminación y colección en la vaca.

El tratamiento con FSH–P comienza el día 10 del ciclo estral, el celo está indicado como día O, la inseminación es múltiple y la colección se realiza 6–8 días después del celo.

Comúnmente la FSH se usa en dosis totales que varían entre 30–50 mg divididas en 8–10 inyecciones que son colocadas cada 12 hrs. en forma subcutánea (SC) o intramuscular O M) M) Cincuenta y seis a 72 hrs. después de haber sido inyectada la primera dosis de FSH, se inyecta Prostaglandina F–2 alfa (25–30 mg) para inducir la regresión del CL del ciclo. La presentación del celo ocurre aproximadamente 48–56 horas más tarde (Alcivar y col, 1983; Murphy y col, 1984).

La PMS–G se inyecta en dosis única que varían entre 1500 y 2800 UI (IM), 48 hrs. después, se inyecta Prostaglandina F–2 alfa. El celo se presenta aproximadamente 48–56 hrs. más tarde (Critser y col, 1980).

INSEMINACION

Al celo, la donante se insemina cada 12 hrs. por 2–4 veces usando una o más dosis de semen en cada inseminación. Esto se realiza para aumentar las posibilidades de fertilización de los oocitos liberados. Aproximadamente 7 a 8 días más tarde estos oocitos o embriones son recuperados desde el útero de la donante, ya sea utilizando métodos quirúrgicos o no quirúrgicos de colección (ver más adelante).

MEDIOS DE CULTIVO

Existe una gran variedad de medios de cultivo (TCM–199), PBS, HAM–F10, etc.) que pueden utilizarse para recolectar oocitos, el más usado actualmente es el Dulbecco's fosfato buffer salino (PBS) (Gibco, Grand Island N.Y.). Este medio tiene la particularidad que su buffer es fosfato lo que lo hace más estable a los cambios de pH. Además, es un medio de fácil preparación, sus componentes son encontrados sin mayores problemas en el comercio y son de relativo bajo costo.

Comúnmente se habla de 2 tipos de medios de cultivos. El medio de colección o de lavado (flushing) y el medio de mantención (Cuadro 1). La diferencia fundamental entre ambos radica en la cantidad de proteína agregada,el primero posee 1–2% de proteína (suero fetal, albúmina bovina, etc.), en cambio el medio de mantención posee 10–20% de proteína y a veces se enriquece con glucosa (1 mg/ml) y piruvato de sodio (0,33 mM).

CUADRO I .

Composición del medio Dulbecco's Fosfato Buffer Salino (PBS),
para colección y mantención de embriones.

Substancia	Colección	Mantención
NaCI	8.00 gr/It	8.00 gr/It
KCI	0.20 gr/It	0.20 gr/It
CaCI	0.10 gr/It	0.10 gr/It
MgCI₂ 6H₂O	0.10 gr/It	0.10 gr/It
Na₂ HPO₄ 2H₂O	1.15 gr/It	1.15 gr/It
KH₂ PO₄	0.20 gr/It	0.20 gr/It
Penicilina	100 U.I.	100 U.I.
Estreptomicina	100 ug	100 ug
Fungizona	25 ug	25 ug
Suero Fetal	1 -2%	10-20%
Piruvato de Sodio		0.33 mM
Glucosa		1 mg/ml

Para preparar 1 litro de medio:

Use agua bidestilada.
Agregue los componentes previamente mezclados (polvo) en un matraz con el agua bidestilada (menos el CaCI) a 15–30° C (temperatura ambiente) y agítelo constantemente.
Una vez que todo el material está en solución agregue el cloruro de calcio (0.10 gr.).
Esterilice inmediatamente usando un filtro de 0.22 um.

Los medios preparados se esterilizan usando un filtro de 0.22μ y se mantienen en refrigeración (4^o C). Al momento de usarse se les agrega antibióticos (penicilina potásica: 100 UI/ml y sulfato de estreptomicina 100 mg/ml y antihongos (fungizona 25 mg/ml).

COLECCION DE OOCITOS

Todo el equipo (catéter, jeringas, material de vidrio, etc.) que se usa en la colección y transferencia de embriones, se lava cuidadosamente con agua destilada y se esteriliza adecuadamente.

En un principio los oocitos eran colectados haciendo un lavado del útero una vez que la donante era sacrificada. Posteriormente se usó el Método quirúrgico a través de la línea media con el animal bajo anestesia general (Rowson y col 1969), el cual es impracticable en terreno ( no se discutirá en este trabajo), y actualmente se utiliza el método no quirúrgico a través de la vagina. Este último puede realizarse por medio de un circuito cerrado de circulación (por gravedad) o por aspiración interrumpida (Rowe y col, 1976; Rowe y col, 1980b).

Para la colección no quirúrgica de oocitos se han inventado variedades de instrumentos (Drost y col 1976; Eldensen y col 1976; Greve y col 1977; Rowe y col 1976) pero los más comúnmente usados son los catéteres Foley de 2 vías y el modelo Neustadt/Aish (Shneider y Hahn 1979). Las diferencias fundamentales entre ellos redica en el largo y en la consistencia. El modelo Neustadt/Aish es 27 cm. más largo y es más duro que el Foley.

COLECCION NO QUIRURGICA POR ASPIRACION INTERRUMPIDA

A continuación se describe brevemente la colección no quirúrgica por aspiración interrumpida (Fig. 3) por ser una técnica bastante utilizada actualmente en terreno.

Figura 3. Método de recuperaciónpor aspiración interrumpida. Se lavan los cuernos con pequeñas cantidades de medio de cultivo (20-60 ml).

Una vez colocada la donante en un brete se procede a la palpación rectal para estimar el número de CL. Se lava cuidadosamente la región perineal y labios vulvares con agua y jabón, luego se saca y se coloca alcohol. Posteriormente se inyecta una anestesia epidural baja (3–5 ml).

A continuación el catéter se introduce a la vagina y se pasa a través del cérvix para finalmente ser colocado en uno de los cuernos. Muchas veces es recomendable en vaquillas, previo a la introducción del catéter, dilatar el canal cervical por medio de un dilatador de cérvix (Fig. 4) en esta forma se facilita posteriormente la introducción de éste. La fijación del catéter al cuerno se realiza por medio de un globo que va adosado en el extremo. Este se llena con aire (5–15 ml) o suero salino hasta que se sienta que no hay deslizamiento, para esto se recomienda traccionarlo suavemente. Hay que tener presente que la poca o alta presión pueden producir pérdida de líquido y de embriones o desgarros del Debe existir un delicado balance entre ambas presiones.

Figura 4. Diferentes formas de dilatadores de cérvix. a) diámetro menor 3 mm. (extremo), b) diámetro mayor 8 mm., c) largo 50 cm.

Ubicado el catéter y asegurándose que no existen torcimientos del cuerno que podrían resultar en desgarros por alta presión de líquido en pequeñas porciones de éste se procede a realizar el lavado (flushing).

El medio se introduce previamente entibiado (37° C) en pequeños volúmenes que van desde 20 a 60 ml cada vez, por 5 a 8 veces, a través de una jeringa que se adosa al extremo libre del catéter. Debe procurarse que el medio alcance todas las áreas del endometrio. Muchas veces, este es agitado con la misma jeringa haciendo movimientos de entrada y salida por un par de veces. Así en esta forma se producirán turbulencias y los embriones que se encuentran ubicados en los pliegues de la mucosa uterina pueden ser arrastrados más fácilmente. Terminado el lavado de un cuerno se repite la maniobra en el otro cuerno.

El medio de cultivo colectado (probetas, bulbos, etc.) se deja reposar aproximadamente por 30 minutos para que los oocitos que flotan en él decanten (Fig. 5).

Finalizado los lavados es recomendable colocar una solución antibiótica dentro del útero de la vaca para prevenir posibles metritis. También es una práctica común inyectar (IM) Prostaglandina F–2 alfa ya sea inmediatamente después de la colección u 8 a 10 días más tarde, para producir luteolisis de los CL presentes. Esto permitirá inducir celo en la donante y volver al programa reproductivo del predio más rápidamente, o podría continuar como donante en un programa de transferencia, superovulándola nuevamente 60–90 días más tarde.

Figura 5. Medio de cultivo con embriones (lavado del útero) colectado en bulbos y probetas. Se deja decantar por 30 min. y se vacia en copas abriendo la pinza (A) en el caso de ser colectado en bulbos o en el caso de usar probetas, el líquido restante se coloca en copas o placas Petri para posteriormente realizar la búsqueda de los oocitos.

BÚSQUEDA, IDENTIFICACION Y CLASIFICACION DE LOS OOCITOS

Cuando los lavados han sido colectados en probetas la parte superior del medio se extrae por medio de sifonaje dejando aproximadamente 100 a 200 ml en el fondo. Este medio restante se coloca posteriormente en placas petri y se observa bajo el estereoscopio, generalmente usando un aumento de 10x. En el caso de usar bulbos la extracción del medio a observar se realiza a la inversa (Fig. 5).

Los oocitos que se encuentran son retirados de la placa con una pipeta Pasteur o cánula plástica y colocados en un medio de cultivo fresco. Posteriormente se observan a mayor aumento (40x ó 70x) para ser identificados y clasificados.

Existen diferentes técnicas para clasificar los oocitos en viables y no viables, por ejemplo tinciones vitales (Kardymowicz, 1972), cultivos (Renard y col 1980), técnicas que miden el metabolismo (Schilling y col 1979) etc., pero estas son difíciles de realizar en condiciones de terreno. Actualmente la forma más popular de clasificación se basa en una apreciación subjetiva, utilizando el microscopio estereoscópico.

IDENTIFICACION Y CLASIFICACION MORFOLOGICA A TRAVÉS DEL ESTEREOSCOPIO.

IDENTIFICACION

La identificación se realiza tomando como base el estado de desarrollo de los oocitos (para mayores detalles ver Lindner y Wright 1983).

En un lavado (día 5–9) se pueden encontrar oocitos de diferentes estados, por ejemplo (Fig. 6):

Oocito no fertilizado

Zona pelúcida vacía

Oocitos de 8 células: 1 x 8

Oocitos de 16 células: 1 x 16

Mórula

Mórula compacta

Blastocisto

Blastocisto expandido

Blastocisto eclosionado o por eclosionar.

Figura 6. Algunos ejemplos de oocitos bovinos de 7-8 días de edad.

CLASIFICACION

Con la clasificación se pretende evaluar la calidad del embrión (viabilidad) basándose en la comparación de una serie de parámetros, como número, tamaño y forma de las blastómeras, número de vacuolas espacio perivitelino, color, forma de la zona, etc.

Los oocitos son clasificados de acuerdo a la apreciación subjetiva de estos parámetros en: EXCELENTES, BUENOS, REGULARES (incluye oocitos fertilizados = embriones) y MALOS (no fertilizados y fertilizados degenerados, Cuadro 2).

CUADRO II

Clasificación de Oocitos colectados
entre los días 5–9 después del estro.

Puntaje
Transferible (incluye oocitosfertilizados)	EXCELENTE	1
	BUENO	2
	REGULAR	3
No Transferible (incluye oocitos nofertilizados dege-nerados),	MALO	4

Distinguir entre oocitos fertilizados y no fertilizados no es difícil. Sin embargo, clasificar los oocitos fertilizados requiere de cierta experiencia. El problema fundamental radica en saber con seguridad si el embrión clasificado como transferible es viable y si es clasificado como no transferible es realmente no viable. Quizás la única forma de saberlo será transfiriéndolo en una receptora y esperar el resultado.

Aún así, esto no es totalmente 'seguro ya que hay otra serie de factores ajenos al embrión que influenciarán en la viabilidad, como por ejemplo: técnica de transferencia (quirúrgica o no quirúrgica), sincronización donante/receptora, medio de cultivo, etc.

Los oocitos fertilizados y clasificados como 1, 2, 3 son colocados en medios de cultivo de mantención y guardados en incubador a 37º C para luego ser transferidos a las receptoras.

RECEPTORAS

La inducción de celo con Prostaglandina F–2 de las receptoras debe estar de acuerdo con el programa de superovulación de la o las donantes. Estas recibirán una inyección de Prostaglandina F–2 veinticuatro horas antes o en el mismo momento que la recibe la donante. Comúnmente la relación es 10 receptoras por cada donante. Lo más recomendable en condiciones de terreno es realizar 2 o más donantes en el mismo día, así la utilización de las receptoras se realiza en mejor forma.

Las receptoras que presenten celo (en forma natural o inducido) con una diferencia de ± 24 horas con respecto al celo de la donante serán las receptoras (sincronizadas) seleccionadas prioritaria mente para recibir los embriones.

En el caso que hubiese más embriones que receptoras sincronizadas se puede recurrir a receptoras que han presentado celo ± 36 6 ± 48 hrs. del celo de la donante, lógicamente las posibilidades de preñez serán menores.

Un programa práctico de sincronización y colección es por ejemplo: realizar 6 donantes con 60 receptoras. Comenzar el tratamiento de superovulación en 3 donantes (Grupo A) y preparar 30 receptoras –(PGF 2 alfa) el próximo día comenzar el tratamiento de las donantes y receptoras restantes (Grupo B, Fig. 7).

Figura 7. Programa práctico de T. de E. utilizando 3 donantes y 30 receptoras en cada grupo (A y B). Se considera que todas las donantes manifestaron celos (antes del tratamiento) el mismo día. Las donantes A comienzan el tratamiento de superovulación el día 10 del ciclo estral, en cambio las donantes B comienzan el día 11. Las receptoras reciben 1 dosis única de Prostaglandina F-2 alfa un día antes o el mismo día que la reciben las donantes.

En este ejemplo se maximiza la utilización de las receptoras, ya que estas pueden intercambiarse con las donantes del Grupo A ó B.

Las 6 donantes pueden ser colectadas el mismo día (calendario) o pueden ser colectadas con un día de diferencia, pero el programa de sincronización no cambia. Es recomendable palpar todas las donantes antes de colectar para tener una estimación del número de CL, esto reflejará en forma apróximada el número de oocitos a colectar. En base a estos datos se distribuyen las receptoras. Programas como éste pueden realizarse con mayor número de donantes.

COLOCACION DE LOS EMBRIONES EN RECEPTORAS

Los embriones pueden ser transferidos quirúrgicamente, realizando una laparatomía ventral bajo anestesia general (Rowson y col 1969) o a través del flanco, con anestesia local (Evans y col 1979) o no quirúrgicamente: a través de la vagina (Rowe y col 1980a). Es recomendable para un técnico que recién comienza a transferir los embriones, utilizar la técnica quirúrgica por el flanco ya que requiere menos experiencia, que la no quirúrgica, esto lo familiarizará con el trabajo y obtendrá seguramente, mejores resultados de preñez.

TÉCNICA DE TRANSFERENCIA QUIRÚRGICA A TRAVÉS DE LA LAPARATOMIA LATERAL.

La receptora es colocada en un brete que permita posteriormente realizar la laparatomía lateral izquierda o derecha. Primero se procede a realizar un examen rectal de la receptora para constatar la presencia de CL (Evans y col 1979; Del Campo y col 1976).

Una incisión paralela a la última costilla y de no más de 10 cm. de longitud se realiza al lado adyacente del ovario que posee el CL, lo más posterior que sea posible (aproximadamente a una mano de distancia de las apófisis de las vértebras lumbares y a una mano del borde de la última costilla).

Los preparativos de asepsia de la operación son similares a cualquier intervención quirúrgica (corte de pelo en el área, lavado y desinfección). Una vez hecho ésto, se procede a inyectar anestesia local (xilocaína al 2%) por infiltración, se incide la piel y las capas de tejido. El músculo oblicuo abdominal interno y el músculo recto son separados con los dedos o una pinza roma. Luego se introduce una mano a la cavidad abdominal y se procede a identificar nuevamente el CL palpando los ovarios directamente o visualizándolo a través de la incisión si es posible. Después se exterioriza el cuerno adyacente al CL traccionando el ligamento ancho a la altura del tercio distal de éste. Para una mejor sujeción del cuerno se usan compresas de gasa entre los dedos pulgar e índice. Luego el cuerno es puncionado aproximadamente a 5–8 cm. de la unión útero–tubárica con la parte roma de una aguja de sutura o estilete pequeño hasta alcanzar el lumen. Inmediatamente después el embrión, es depositado en el lumen uterino usando una cánula de plástico (Fig. o una pipeta Pasteur, la que ha sido cargada previamente con el embrión de tal forma que éste se ubique entre 2 espacios de aire y medio de cultivo (Fig. g). Posteriormente la cánula es retirada lentamente y el cuerno es devuelto a la cavidad abdominal. Luego la herida operatoria es suturada.

Figura 8. Técnica de transferencia quirúrgica a través de la laparatomía lateral. El extremo del cuerno es sostenido traccionando el ligamento ancho a la altura del tercio distal del cuerno. Se abre un orificio pequeño en el cuerno con un estilete y se introduce la cánula cargada con el embrión hasta estar seguro que está su extremo en el lumen, luego el embrión se deposita en el lumen.

Figura 9. Forma de cargar una cánula con el embrión para transferir en forma quirúrgica.

TÉCNICA DE TRANSFERENCIA NO QUIRURGICA TRANSCERVICAL

Una vez realizado el examen rectal de la receptora y constatada la presencia de un CL se inyecta una anestesia epidural baja (solución de xilocaína al 2%). La región perineal y vulva se lavan con jabón desinfectante y agua y, se secan (Rowe y col 1980a).

El embrión es entonces colocado dentro de una pajuela esterilizada (0.25–0.5 ml) a la que se le ha cortado un extremo (aproximadamente 1,5 cm.), ésto se realiza para que no se doble al ser introducida en el cérvix con la consiguiente pérdida del embrión. La colocación del embrión dentro de la pajuela se realiza de tal forma que el medio que posee el embrión queda entre 2 gotas de medio; separadas por aire (Fig. 10).

Posteriormente la pajuela con el embrión se coloca dentro de la pistola de Cassou y ésta dentro de la pipeta plástica que, previamente ha sido esterilizada.

Con la mano izquierda el operador sujeta el cérvix a través de la pared del recto. La pipeta se introduce en el canal cervical y su extremo se ubica, con ayuda de la mano izquierda, en el cuerno ipsilateral al CL. Una vez en la posición deseada (un poco más allá del cuerpo del útero) el embrión es depositado suavemente y la pistola se retira lentamente. Todo este procedimiento debe realizarse lo más rápido y delicadamente posible. El exceso de manipulación producirá daño a la mucosa del útero, que se traducirá en una baja en los resultados (Rowe y col 1980a; Trowson y col 1978).

Aparte de la destreza y experiencia que son necesarias, con cualquiera de las técnicas descritas, es necesario que las receptoras sean animales sanos, que sus ciclos reproductivos hayan sido normales y que estén en buen estado de nutrición. En la medida que las receptoras estén en buenas condiciones, tanto sanitarias como nutricionales y reproductivas, y la técnica sea bien realizada, la eficiencia de la transferencia de embriones, traducida en preñeces, será mayor.

Figura 10. Transferencia no quirúrgica. Forma de cargar una pajuela con el embrión.

OTRAS POSIBILIDADES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES ACTUALMENTE USADA EN TERRENO

CRIOPRESERVACION DE EMBRIONES.

Un problema que presenta la transferencia de embriones en terreno es la preparación de gran número de receptoras, que muchas veces el criador no puede mantener, debido al alto costo.

La preservación de embriones a bajas temperaturas abre una nueva oportunidad para la ganadería, ya que en este caso los embriones pueden ser transferidos en cualquier momento, utilizando incluso una receptora o preparando grupos de receptoras (Lehn–Jensen y Greve 1981).

PRODUCCION DE MELLIZOS

Utilizada especialmente en ganado de carne. Existen tres posibilidades de producir mayor cantidad de crías por medio de transferencia: a) colocando 2 embriones extraños en una receptora (Anderson y col 1977; Renard y col 1977; Anderson 1978); b) colocando 1 embrión extraño en receptoras previamente inseminadas (Sreenan y Mc Donagh 1979; Testar y col 1975); c) usando mitades de embriones obtenidos a través de microcirugía (Ozil, 1983). En éste último caso la receptora recibirá 2 mitades de un mismo embrión, lo que obviaría el problema de Freemartin. Esto permitiría producir mellizos en animales de lechería.

Las posibilidades que se tienen en la reproducción animal con el uso de estas nuevas tecnologías son incalculables, pero también hay que tener presente los problemas que de ellas pueden derivar.

TÉRMINOS
–	CATÉTER FOLEY: Instrumento que se ocupa para vaciar la vejiga urinaria humana y que se usa para recolectar oocitos.
–	CALOR, CELO, ESTRO: Período de receptividad sexual en la hembra.
–	CUERNO IPSILATERAL: Cuerno adyacente al ovario que posee el cuerpo lúteo.
–	DONANTE: Hembra de la cual se colectan oocitos.
–	DULBECO'S PBS: Medio de cultivo, fosfato buffer salino.
–	EMBRION: Huevo fertilizado, oocito fertilizado, ovum.
–	FREEMARTIN: Una hembra nacida de una preñez de mellizos (macho / hembra). Generalmente la hembra es estéril.
–	FSH–P: Hormona folículo estimulante porcina.
–	GONADOTROFINA: Hormona que estimula los ovarios y testículo.
–	OOCITO: Huevo no fertilizado.
–	PGF₂α: Prostaglandina F–2 alfa.
–	PMS–G: Gonadotrofina sérica de yeguas preñadas.
–	RECEPTORA: Hembra que recibe un oocito proveniente de otra hembra.
–	SUPEROVULACION: Estimulación ovárica a base, generalmente de gonadotrofinas, para producir una mayor cantidad de folículos, que la normal.
–	TCM–199: Medio de cultivo de tejidos.

Mejora del porcentaje de implantación embrionaria

Varios colegas investigadores en USA y Argentina, han descubierto que para mejorar la implantación embrionaria hay que tener en cuenta los factores conocidos que influyen en ella.

Dentro de estos factores hay dos conocidos bien importantes en el trópico

STRESS CALÓRICO
NIVELES DE PROGESTERONA SÉRICA EL DIA DE LA TRANSFERENCIA EN LA RECEPTORA

En nuestros países tropicales NO debemos transferir embriones en el periodo del dia de 10 de la mañana hasta las 4 de la tarde, lo debemos realizar bien temprano en la madrugada o bien tarde en la noche, esto sumado a un manejo adecuado produciendo el mínimo de stress posible, ademas de seleccionar receptoras mansas, ha aumentado el porcentaje de implantación de embriones.

Investigadores han dicho y comprobado en sus estudios que niveles sericos por debajo de 2ng de progesterona en la receptora el dia 7,dia de transferencia, no permite una implantación.
Por tanto la palpación del cuerpo luteo basado en su tamaño, no siempre va ligado con la calidad excretora de progesterona por el mismo.Esto lo realizaron en mas de 1000 novillas en Argentina.

Entonces se sugiere una prueba sérica o en leche, de niveles de progesterona. En el mercado NO conozco una prueba rapida de progesterona cuantitativa en sangre, solo conozco una prueba cualitativa de progesterona en leche.
Si nuestras receptoras son vacas en lactancia, se podría por lo menos analizar si los niveles de progesterona estan altos o bajos, pero no el valor serico.Si nuestras receptoras son novillas que no dan leche, no tendríamos mas que tomar una muestra de sangre y valorar el suero en laboratorio lo cual es demorado, mas costoso y poco practico.

Entonces en mi experiencia y basado en el manejo de la reproducción humana en donde el óvulo que formara el embrión pertenece a la misma donante( FIV,ICSI),y mantienen los niveles de progesterona desde la prueba positiva de embarazo hasta el parto, (en los bovinos la receptora NO tiene nada que ver con la donante) , decidí usar los implantes vaginales para mantener un nivel permanente de progesterona en sangre, esto es lo mas practico y sencillo.

El trabajo lo realizamos asi

TRANSFERENCIA DEL EMBRIÓN previa palpación del cuerpo luteo y previo paso del dilatador, con embriones frescos y congelados, implante vaginal CIDR desde el dia de transferencia hasta 13 dias después, retiro del CIDR y observación de presentación de calores, la receptora que presento repetición de calor NO implanto.

La novilla que No presenta calor se le coloca nuevamente un CIDR tres a cuatro dias después, y volvemos a retirarlo 17 dias después, y lo mismo en el siguiente ciclo ( lo realizo tres veces) lo que me da un mantenimiento de embrión SI esta implantado por mas o menos 60 dias, realizo la palpación diagnostica con ecografía, y termino mi trabajo.
Si en el algún caso aborta luego de 60 dias NO tuvo que ver con la implantación si no con el desarrollo del feto .

Esto lo hemos realizado con embriones HOLSTEIN, PARDO SUIZO, SIMMENTAL,SENEPOL Y ANGUS incrementandose la implantación en un 12 mas en congelados y un 16 mas en fresco.

También lo utilizo en vacas preñadas con presentación de abortos NO infecciosos , o sin causa determinada desde la palpación diagnostica hasta el parto, 1 CIDR mensual.

Otro manejo podría ser inyectar diariamente progesterona intramuscular , lo que NO es practico y mucho menos ayudaría por el permanente STRESS a que son sometidas las receptoras.